固定相的選擇對樣品的分離起著重要作用，有時甚至是決定性的作用。不同類型的色譜采用不同的固定相，如氣-固色譜的固定相為各種具有吸附活性的固體吸附劑；氣-液色譜的固定相是載體表面涂漬的固定液，液相色譜中的固定相為各種鍵合型的硅膠小球，離子交換色譜中的固定相為各種離子交換劑，排阻色譜中的固定相為各種不同類型的凝膠等等。
基質及其性質
硅膠
硅膠是HPLC填料中最普通的基質。硅膠除了具有良好的機械強度、容易控制的孔結構和比表面積、較好的化學穩定性和熱穩定性以及專一的表面化學反應等優點外，還有一個突出的優點就是其表面含有豐富的硅羥基。
氧化鋁
具有與硅膠相同的良好物理性質，也能耐較大的PH范圍。它也是剛性的，不會在溶劑中收縮或膨脹，但與硅膠不同的是，氧化鋁鍵合相在水性流動相中不穩定
